Desenhamos e avaliamos primers para editar genomas de bactérias. Com o auxílio de ferramentas de bioinformática, planejamos primers capazes de remover o gene csgA de uma cepa de Escherichia coli e substituí-lo por um gene de resistência a antibiótico. Também verificamos se eram eficientes e específicos, garantindo que poderiam ser utilizados posteriormente em experimentos de edição genética e em estudos sobre o papel dessas bactérias na saúde humana.
Autores: Ana Clara da Silva Teixeira Santos, David Aciole Barbosa, Pedro Henrique Yanaze Brolacci, Ana Vitória Santos Souza, Marcelo Palma Sircili
1. Introdução
O nosso intestino abriga uma grande comunidade de microrganismos, conhecida como microbiota intestinal. A maioria dessa comunidade é formada por bactérias que vivem em equilíbrio conosco e influenciam diversas funções do corpo, incluindo o sistema imunológico e o sistema nervoso. Muitas dessas bactérias crescem formando biofilmes, que são comunidades organizadas aderidas a superfícies e envolvidas por uma matriz protetora [1].
Dentro desses biofilmes, algumas bactérias produzem estruturas chamadas curli. Elas podem compor até 85% da matriz extracelular e funcionam como pequenos fios feitos de proteínas do tipo amiloide, ajudando as bactérias a se prenderem umas às outras e ao ambiente ao redor, aumentando sua resistência [2]. O que chama a atenção é que essas curli são muito semelhantes às proteínas amiloides humanas envolvidas na doença de Alzheimer. Além disso, o sistema imunológico reconhece tanto os amiloides bacterianos quanto os humanos pelos mesmos receptores, o que sugere que as curli também podem estimular processos inflamatórios [3]. Estudos recentes mostram, ainda, que essas estruturas bacterianas podem facilitar a formação de agregados de proteínas humanas associados a doenças neurodegenerativas [4].
Visto que as curli estão presentes tanto nos biofilmes de bactérias comuns do intestino quanto nas bactérias que causam doenças, é possível que elas influenciem condições gastrointestinais e neurodegenerativas [5]. No entanto, os mecanismos que conectam as curli à comunicação entre intestino e cérebro ainda não são totalmente compreendidos.
Para ajudar a esclarecer esse processo, nosso estudo busca criar uma bactéria que não produz curli, denominada linhagem ∆csgA. Utilizamos ferramentas computacionais para desenhar primers (pequenas sequências de DNA) que orientarão a edição do genoma (material genético) da Escherichia coli. A edição genética será realizada com o auxílio do sistema λ-Red, que funciona, de forma simples, como um mecanismo de “recortar e colar”: ele remove um trecho específico do DNA e insere outro no lugar correto [6].
O objetivo é remover o gene csgA, responsável por codificar a principal parte das fímbrias curli, e substituí-lo por um gene que confere resistência ao antibiótico cloranfenicol, como forma de seleção no cultivo desta bactéria. A linhagem utilizada, E. coli aEPEC Ba4157, foi previamente isolada em Salvador, Bahia, em um estudo anterior [7]. Com essa bactéria modificada, será possível investigar com mais precisão como a presença ou ausência das curli influencia processos inflamatórios e como isso pode se relacionar com a forma pela qual a microbiota afeta o sistema nervoso.
Resultados e discussões
Para dar início à construção da bactéria modificada, desenhamos os primers, que serviram como pontos de partida para localizar e copiar regiões específicas do DNA. Como a sequência do material genético da bactéria-alvo ainda não está disponível em bancos públicos, utilizamos como referência o genoma de outra linhagem de Escherichia coli, chamada E. coli 042. Antes disso, confirmamos, com a ajuda da ferramenta BLAST [8], que o gene csgA é conservado entre diferentes linhagens, o que nos permitiu usar esse genoma como modelo.
Com essa base, iniciamos a construção dos primers necessários para realizar a edição gênica. Eles foram feitos em duas partes: a primeira corresponde às regiões do DNA que ficam próximas ao gene que queremos remover, chamadas upstream e downstream, em uma distância de 40 pares de bases (medida utilizada para descrever uma distância no DNA). A segunda parte contém uma sequência universal correspondente ao gene de resistência ao cloranfenicol, que será inserida no lugar do gene original. Essa estratégia permite gerar o DNA substituto que será usado para realizar a troca, em um processo conhecido como formação do cassete de deleção por primers de mutagênese. Além disso, planejamos primers extras (de confirmação) posicionados a uma distância de 200 pares de bases antes e depois do gene csgA, que servirão para confirmar se a deleção realmente ocorreu na região desejada.
Depois que as sequências dos primers foram desenhadas, garantimos que elas funcionariam bem nas reações de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), técnica utilizada para amplificar os trechos específicos do DNA. Para isso, utilizamos o programa PrimerQuest™ Tool [9], que analisa características importantes, como a temperatura em que as fitas de DNA se separam, a proporção de bases GC, que influencia a estabilidade das moléculas, e a possibilidade de formação de estruturas secundárias indesejadas, como os hairpins. Esses fatores são essenciais para garantir que os primers funcionem corretamente durante a amplificação.
A especificidade dos primers, ou seja, a capacidade de cada um se ligar exatamente ao trecho correto do DNA, também foi verificada com a ferramenta Primer-BLAST [10]. Esse teste compara as sequências dos primers com o genoma de referência para garantir que eles não se prendam em regiões indesejadas. Os resultados mostraram que os primers se alinham corretamente ao DNA da E. coli 042 e produzem fragmentos do tamanho esperado. Esses resultados podem ser visualizados na Figura 1, para os primers de mutagênese, e na Figura 2, para os primers de confirmação, indicando que eles funcionam de forma confiável e são adequados para realização do experimento.
Figura 1. Resultados da análise no Primer-BLAST para os primers de mutagênese. Geração de fragmento de 528 pares de bases.
Figura 2. Resultados da análise no Primer-BLAST para os primers de confirmação. Geração de fragmento de 927 pares de bases.
Com isso, podemos destacar que o uso de ferramentas de bioinformática foi essencial para tornar o processo mais preciso e eficiente. Elas permitiram realizar a avaliação in silico dos primers, incluindo a análise da temperatura de melting, do conteúdo GC e da previsão de estruturas secundárias, como hairpins, que poderiam atrapalhar a PCR. Esse conjunto de verificações reduz erros, economiza tempo e orienta melhor os testes em bancada. Em pesquisas que investigam como microrganismos influenciam doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, essa precisão é indispensável para manipular o genoma bacteriano de forma controlada e gerar modelos confiáveis que ajudem a compreender o impacto da microbiota no sistema nervoso.
Referências
[1] SARKAR, S. R.; MAZUMDER, P. M.; BANERJEE, S. Probiotics protect against gut dysbiosis associated decline in learning and memory. Journal of Neuroimmunology, v. 348, p. 577390, 2020. doi: https://doi.org/10.1016/j.jneuroim.2020.577390.
[2] MILLER, A.; BESSHO, S.; GRANDO, K.; TUKEL, Ç. Microbiome or Infections: Amyloid-Containing Biofilms as a Trigger for Complex Human Diseases. Front Immunol. 2021 Feb 26;12:638867. doi: 10.3389/fimmu.2021.638867.
[3] HALIMI, H.; AHMADI, B.; ASRI, N.; ROSTAMI-NEJAD, M.; HOURI, H. The roles of functional bacterial amyloids in neurological physiology and pathophysiology: Pros and cons for neurodegeneration. Microbial Pathogenesis, v. 200, p. 107363, 2025. doi: https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.107363.
[4] OLSÉN, A.; WICK, M. J.; MÖRGELIN, M.; BJÖRCK, L. Curli, fibrous surface proteins of Escherichia coli, interact with major histocompatibility complex class I molecules. Infection and Immunity, v. 66, n. 3, p. 944–949, 1998. doi: https://doi.org/10.1128/IAI.66.3.944-949.1998.
[5] POLIDO, S. A.; STUANI, C.; VOIGT, A.; BANIK, P.; KAMPS, J.; BADER, V.; GROVER, P.; KRAUSE, L. J.; ZERR, I.; MATSCHKE, J.; GLATZEL, M.; WINKLHOFER, K. F.; BURATTI, E.; TATZELT, J. Cross-seeding by prion protein inactivates TDP-43. Brain, v. 147, n. 1, p. 240–254, 2024. doi: https://doi.org/10.1093/brain/awad289.
[6] DATSENKO, K. A.; WANNER, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, n. 12, p. 6640–6645, 2000. doi: https://doi.org/10.1073/pnas.120163297.
[7] BUERIS, V.; SIRCILI, M. P.; TADDEI, C. R.; DOS SANTOS, M. F.; FRANZOLIN, M. R.; MARTINEZ, M. B.; FERRER, S. R.; BARRETO, M. L.; TRABULSI, L. R. Detection of diarrheagenic Escherichia coli from children with and without diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 102, n. 7, p. 839–844, 2007. doi: https://doi.org/10.1590/s0074-02762007005000116.
[8] NCBI. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. National Center for Biotechnology Information. Disponível em: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome. Acesso em: 24 out. 2025.
[9] INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES (IDT). PrimerQuest™ Tool. Coralville, IA, USA. Disponível em: https://www.idtdna.com/pages/tools/primerquest. Acesso em: 24 out. 2025.
[10] NCBI. Primer-BLAST. National Center for Biotechnology Information. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Acesso em: 24 out. 2025.