Preditores farmacocinéticos e toxicológicos in silico para via oral: conheça e análise ADMETox

O desenvolvimento de fármacos demanda tempo e recursos financeiros devido às muitas fases experimentais envolvidas no processo. Com a evolução tecnológica, a utilização de ferramentas de bioinformática possibilitou a otimização de etapas como a triagem de um grande número de compostos e avaliação de propriedades farmacocinéticas e toxicológicas. Atualmente, a predição dos parâmetros de Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMETox) pode ser realizada através de programas computacionais e servidores web. No presente trabalho, serão esclarecidos alguns conceitos relacionados à farmacocinética, além da exemplificação de preditores disponíveis e algumas de suas funcionalidades.

Autores: Raíssa Santos de Lima Rosa^{https://orcid.org/0000-0001-6855-5051}, Maria Eduarda Alves Esteves ^{https://orcid.org/0000-0002-2029-235}, Ana Carolina Silva Bulla ^{https://orcid.org/0000-0003-4118-294X}, Manuela Leal da Silva ^{https://orcid.org/0000-0003-4844-7138}

Revisores: Diego Mariano^{https://orcid.org/0000-0002-5899-2052} , Lucianna Helene Santos^{https://orcid.org/0000-0002-6910-0697}

Introdução

Desde a identificação de uma molécula até a formulação de um medicamento, são necessárias diversas etapas até a obtenção de um produto final seguro e eficaz. Os fármacos inicialmente tinham como origem produtos naturais, em sua maioria plantas [1]. Independentemente de sua origem, para que tal substância chegue ao local de ação com concentração adequada e tenha efeito biológico, uma série de reações divididas em farmacêutica, farmacocinética e farmacodinâmica precisam acontecer. Dessa forma, o processo de desenvolvimento de fármacos é tanto custoso como laborioso, podendo levar cerca de 15 a 20 anos para conclusão [2]. O avanço tecnológico contribuiu na otimização deste processo, de maneira que metodologias computacionais auxiliam na triagem de um grande número de compostos e na avaliação de interação entre o complexo receptor-ligante. Da mesma maneira, também podem ser empregadas na predição de parâmetros farmacocinéticos, facilitando a filtragem de substâncias a serem testadas por métodos in vitro e in vivo, reduzindo o tempo e recursos envolvidos no processo de desenvolvimento de fármacos, bem como ilustrado na Figura 1.

A forma física na qual um fármaco é administrado é chamada de forma farmacêutica. Através de sua manipulação, busca-se por efeitos locais e sistêmicos diferentes [4] . Os estudos para atingir tais objetivos envolvem a farmacocinética, em específico o estudo da variação de concentração do fármaco em diferentes fluidos corporais em determinado tempo. A variação envolve o que chamamos de ADMETox: Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade, para além de outros fatores como idade e sexo do paciente¹. Os estudos desses efeitos em conjunto caracterizam-se pela preocupação acerca do resultado das interações de biomacromoléculas. Estas interações estão intimamente ligadas a propriedades físico-químicas como: solubilidade, ligações hidrogênio, lipofilicidade, dentre outros [5]. Neste sentido, a farmacologia pode ser dividida em estudos de farmacocinética e farmacodinâmica, como ilustrado na Figura 2. A farmacocinética pode ser resumida pelos parâmetros ADMETox, que investigam o comportamento de uma substância desde a sua administração até sua excreção. Já a farmacodinâmica esclarece a dinâmica de uma substância, ou seja, seus efeitos fisiológicos no organismo; e tem como função estudar o local de ação do fármaco, a atração das interações com seu alvo, assim como a eficácia deste composto [6] .

De forma a auxiliar no processo de desenvolvimento ou reposicionamento de um fármaco, as ferramentas preditoras de parâmetros ADMETox, como SwissADME, Osiris, ADMETLab e pkCSM, são de extrema relevância. Estas ferramentas calculam, por métodos diferentes, diversos critérios farmacocinéticos envolvidos na absorção da substância em estudo, como por exemplo, a massa molecular, que pode interferir na passagem intermembranar.

Desmistificando conceitos ADMETox

O conceito de absorção é definido como a passagem de um fármaco de seu local de administração para o plasma. É um fator que avalia a capacidade de um composto passar por barreiras biológicas até alcançar um determinado alvo. Em se tratando de biodisponibilidade oral, a substância precisa chegar à corrente sanguínea, através de superfícies como mucosas e aparelho digestivo e outros fatores que circundam [7].

Um conceito bem esclarecido é que a massa molecular influencia diretamente na absorção de um composto. Não há uma regra estabelecida, contudo, é conhecido que fármacos de alta massa molecular, superior a 500 Daltons – Da, tendem a ter dificuldades em atravessar a membrana, e aqueles com menor massa molecular apresentam maior facilidade em atravessá-la [8].

Adicionalmente, a área de superfície polar molecular (do inglês polar surface area – PSA) é um parâmetro definido através da soma das superfícies de átomos polares em uma molécula, e está diretamente relacionada com a absorção intestinal humana. Porém, o cálculo propriamente dito consome bastante tempo devido à complexidade de gerar um modelo molecular tridimensional e avaliar a sua geometria, o que exige programas especializados. Por isso, atualmente a maioria dos preditores usam o TPSA (do inglês, topological polar surface area). A área de superfície polar topológica (TPSA) é um descritor que mostra a correlação com o transporte molecular passivo através de membranas, que permite a predição da absorção intestinal humana, permeabilidade da barreira hematoencefálica e permeabilidade de monocamadas de Caco-2. Deste modo, TPSA é uma métrica química comumente usada para a otimização da capacidade de um fármaco permear as células [9] .

A permeação das monocamadas de Caco-2 (adenocarcinoma do cólon humano) se baseia em ensaios experimentais nessa linhagem de células para estimar a absorção. Em metodologias computacionais um modelo robusto é gerado como padrão, geralmente determinado número de moléculas com valores conhecidos de HIA (do inglês, human intestinal absorption). O número de moléculas vai variar de acordo com o programa, por exemplo no caso do SwissADME foram usadas 660 moléculas para a parametrização do programa [10].

A lipofilicidade de um fármaco contribui diretamente para a solubilidade, permeabilidade e potência de uma substância. O coeficiente de partição (LogP) está relacionado à determinação da lipofilicidade. Esse coeficiente pode ser definido pela razão entre a concentração da substância na fase orgânica e sua concentração na fase aquosa em um sistema de dois compartimentos (geralmente água e n-octanol), sob condições de equilíbrio. Em programas de predição, o LogP pode ser determinado considerando a soma das contribuições hidrofóbicas de cada um dos átomos ou de cada fragmento da substância química [6, 11] .

As características físico-químicas dos compostos, além da própria fisiologia do indivíduo, também afetam diretamente sua distribuição no organismo, que geralmente ocorre pela corrente sanguínea até o tecido alvo. Dependendo do tamanho e da polaridade molecular, o composto pode ter dificuldade em ultrapassar uma barreira natural, por exemplo. Outro fator que pode alterar a extensão dessa distribuição é a interação com proteínas plasmáticas como albuminas, β-globulinas e α-1 glicoproteína ácida. Dessa forma, pela distribuição, o fármaco deve atingir sua concentração efetiva no local desejado [9] .

A passagem de fármacos por um organismo sofre influência de seus processos metabólicos onde diversas reações enzimáticas podem ativar ou inativar sua atividade¹. A maior parte desse metabolismo ocorre no fígado principalmente por meio do citocromo P450 (CYP450), uma superfamília de proteínas de ampla variedade responsável por metabolizar boa parte dos xenobióticos, e da UDP-glicuronil Transferase (UGT) envolvida nas reações de glicuronidação⁴ . No estudo de fármacos, essas reações são divididas em fase 1 e fase 2 onde o principal objetivo é aumentar a hidrossolubilidade favorecendo a eliminação renal do metabólito.

As interações com as CYPs fazem parte das reações de primeira fase do metabolismo que envolvem a oxidação, redução ou hidrólise de substâncias, por exemplo, que são catabólicas e originam geralmente produtos químicos mais reativos². Dentre as diversas proteínas, as CYPs 1, 2 e 3 destacam-se por suas interações com inúmeros fármacos conhecidos. Mais especificamente, as CYP3A4, CYP2D6 e CYP2C9 são protagonistas dessas reações sendo a primeira isoforma responsável por cerca de 50% do metabolismo dos fármacos [12]. Três categorias de fármacos interagem com estas três principais isoformas:

1. Substâncias/fármacos e xenobióticos que são suscetíveis às reações de oxidação, redução ou hidrólise, gerando metabólitos mais facilmente excretados;
2. Inibidores que formam complexos que impedem o metabolismo de substratos;

(iii) Indutores, ligantes que estimulam a produção de CYPs, consequentemente aumentam o metabolismo de substratos.

A eliminação de um fármaco pelo organismo pode envolver diversas vias além da renal, como por exemplo pulmões, pele e trato gastrointestinal. Apesar disso, a via renal é o principal meio de excreção de substâncias hidrossolúveis onde a preocupação é a eliminação total de um composto, caso contrário o acúmulo de compostos exógenos nos tecidos pode produzir efeitos tóxicos. Portanto, faz-se necessária a atenção acerca dos produtos de biotransformação que não são reabsorvidos, como por exemplo, metabólitos de alta polaridade e massa molecular [13] .

Desenvolver um fármaco que seja altamente seletivo e que não apresente alguma toxicidade ainda é um grande desafio [1]. Apesar das companhias farmacêuticas investirem tempo e dinheiro nas pesquisas de toxicidade, ao submeter um novo fármaco a algum órgão regulamentador ainda estão sujeitos a terem seu pedido negado [2]. A toxicidade é caracterizada pelo grau de nocividade a um organismo e, no processo de desenvolvimento de fármacos, diversos ensaios in vitro e in vivo são conduzidos tais como: citotoxicidade, genotoxicidade, interações metabólicas e toxicidade mediada por metabólitos.

O teste de AMES é um bom exemplo de método empregado para avaliar o potencial mutagênico, sendo crucial para o prosseguimento do composto estudado. O modelo de AMES foi desenvolvido usando bactérias da espécie Salmonella typhimurium, sendo descrito pela primeira vez por Bruce Ames em 1970. Atualmente o teste também pode ser feito utilizando Escherichia coli [14]. O teste consiste em um modelo de mutação reversa onde cepas com mutação para produção de um resíduo de aminoácido essencial para sua viabilidade são expostas a compostos testes. Se a exposição a substância levar a uma única alteração nucleotídica, adição ou deleção revertendo a sequência do gene mutado para a sequência do tipo selvagem ou que permita a síntese de uma enzima funcional, a bactéria mutante pode formar uma colônia na ausência do resíduo de aminoácido. Dessa forma, a substância-teste é considerada mutagênica quando o tratamento com a substância causa um aumento no número de colônias [15,16].

Outro caso de citotoxicidade envolve os fármacos que permeiam a BBB (do inglês, Blood-Brain Barrier) e/ou que são hepatotóxicos, por exemplo. A BBB é uma barreira de alta seletividade que protege o Sistema Nervoso Central (SNC) de substâncias que podem ser potencialmente neurotóxicas. O grande desafio acerca da formulação de fármacos é impedir que haja possibilidade de permeação desta barreira uma vez que pode haver danos irreversíveis ao SNC.

Dada a importância de ADMETox e sua avaliação exigir no mínimo 3 anos da condução de análises pré-clínicas utilizando milhares de amostras animais, com os preditores in silico de ADMETox surgiu a oportunidade de otimizar essa etapa [1]. Os métodos computacionais já são reconhecidos como métodos alternativos ao uso de animais em testes. Além disso, há a motivação econômica, ao poupar insumos utilizados em testes realizados experimentalmente [4]. Desde 1990, a indústria vem usando métodos in silico para a triagem de compostos-líderes, visando aumentar a taxa de sucesso em ensaios pré-clínicos, ao selecionar o perfil farmacocinético mais adequado[5] .

Predição in silico de características farmacocinéticas

Como já pontuado, há um grande interesse da indústria farmacêutica em desenvolver modelos de avaliação in silico de características ADMETox. Uma das principais abordagens de tais modelos é a comparação das propriedades físico-químicas de substâncias-teste com as propriedades de fármacos conhecidos, resultando em alguns filtros de druglikeness [4] amplamente utilizados (Tabela 1). Esses filtros envolvem uma série de condições que influenciam diretamente na predição ADMETox quando se trata de fármacos visando a biodisponibilidade oral [10].

Filtro	Parâmetros
Filtro de Egan	AlogP98 ≤ 5,88 TPSA ≤ 131,6
Filtro de Muegge	200 ≤ massa mol. ≤ 600 -2 ≤ XlogP ≤ 6 TPSA ≤ 150 Nº de anéis ≤ 7 Nº de carbonos > 4 Nº de heteroátomos >1 Nº de ligações rotacionáveis ≤ 15 Nº de doadores de ligações de hidrogênio ≤ 5
Filtro de Veber	Nº de ligações rotacionáveis ≤ 10 TPSA ≤ 140
Regra dos 5 de Lipinski	Massa mol. ≤ 500 cLogP ≤ 5 (ou mLogP ≤ 4,15) Nº de doadores de ligações de hidrogênio ≤ 5 Nº de aceptores de ligações de hidrogênio ≤ 10

Dentre os principais filtros, a tradicional regra de Lipinski surgiu em meados do ano de 1997, quando Christopher A. Lipinski e colaboradores, trabalhando para a indústria farmacêutica Pfizer, realizaram experimentos com um conjunto de mais de dois mil fármacos. O objetivo da pesquisa era observar e traçar um padrão físico-químico de substâncias que apresentavam características essenciais para a disponibilidade oral. O resultado da pesquisa de Lipinski culminou na regra dos cinco (do inglês, rule of five – RO5) [17].

A RO5 pode auxiliar químicos no momento de tomada de decisões acerca das modificações químicas evitando compostos com características indesejadas. A regra envolve quatro propriedades: número de doadores e número de aceptores de ligação de hidrogênio, LogP e massa molecular. A mesma regra dita que a substância que possuir menos de cinco doadores de hidrogênio, menos que 10 aceptores de hidrogênio, LogP menor do que cinco e massa molecular até 500 Da terá maior probabilidade de ter uma boa absorção [16,18] .

Devido à ausência de fragmentos químicos no banco de dados desenvolvido por Lipinski e colaboradores, outros parâmetros como alternativa para a biodisponibilidade oral são: de Moriguchi (MLogP)[19,20], de Egan que utiliza o ALogP98 [21], de Wang e colaboradores XlogP3[22].

bRO5

A regra tradicional Ro5 é o padrão ouro ao desenvolvimento de fármacos adotada pelas grandes indústrias farmacêuticas. Contudo, ela pode ser excludente a novas descobertas quando as substâncias-teste ultrapassam parâmetros cruciais, envolvidos no desempenho para a alta absorção de um composto [23]. Como exemplo, pode-se citar os produtos naturais, que normalmente são substâncias que ultrapassam 500 Da, parâmetro estabelecido por Lipinski.

A necessidade de evitar resultados falso-negativos de substância levou ao desenvolvimento da bRo5 (do inglês, beyond the Ro5). A bRo5 engloba desde produtos naturais até antibióticos, antifúngicos e antiparasitários, incluindo antivirais inibidores de protease, como simeprevir e atazanavir com massa molecular igual ou maior que 700 Da[24,25]. Além da massa, os parâmetros de PSA, número de rotações (NRotB – do inglês, number of rotable bonds) e aceptores/doadores de hidrogênio devem ser avaliados com devida atenção às moléculas que se destacarem nesta categoria discutida.

Preditores de características farmacocinéticas in silico

Na literatura podemos encontrar diferentes programas, ferramentas e plataformas que podem ser utilizadas para realizar a predição dessas características farmacocinéticas e toxicológicas, dentre elas o SwissADME [20], pkCSM [26], Molinspiration (disponível em: https://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties), Osiris [27] e ADMETlab (disponível em: https://admet.scbdd.com/). A principal diferença observada nesses programas é a metodologia empregada para a realização das predições.

No SwissADME é oferecido diversos modelos de predição rápida, porém robustas. SwissADME utiliza um extenso conjunto de treinamento para sua rede neural, onde por exemplo, no cálculo de LogP são usadas 9920 moléculas. Além disso, os autores criaram um gráfico para mostrar a correlação inversa de LogP e PSA que devem impactar na HIA (do inglês, Human Intestinal Absorptation) e na BBB o chamado BOILED-Egg, modelo que tem uma representação gráfica em forma de ovo (Figura 3). Logo, os resultados são expostos em um design simples, de fácil interpretação [20].

O SwissADME também é capaz de estimar se um produto químico pode ser substrato da P-gp (glicoproteína – P) ou inibidor das mais importantes isoenzimas da família das CYPs. As CYPs e a P-gp, que são fatores importantes na eliminação de fármacos através da biotransformação metabólica, processam pequenas moléculas para melhorar a proteção de tecidos e organismos [28,29].

Outro programa que faz a predição de características farmacocinéticas e toxicológicas é o pkCSM, que também utiliza aprendizagem de máquina em sua metodologia. O pkCSM possui um conjunto teste de mais de 10 mil moléculas visando uma predição com maior precisão. Leva em consideração as assinaturas gráficas baseadas na distância química das moléculas possuindo trinta preditores no total, sendo dez deles para toxicidade [6,25].

Um dos preditores do pkCSM é a toxicidade de AMES, onde o servidor web utiliza um conjunto de dados teste para a aprendizagem de máquina com mais de 8.000 substâncias com o potencial mutagênico conhecido. Ao final da comparação, o pkCSM retorna ao usuário o potencial mutagênico da substância-teste sob uma resposta qualitativa [25,30] .

Considerações finais

Em suma, o esclarecimento dos parâmetros farmacocinéticos e toxicológicos de uma substância em investigação é de extrema importância aos processos de desenvolvimento ou reposicionamento de fármacos. O estabelecimento da Ro5 permite a seleção de substâncias promissoras neste prosseguimento. Contudo, estudos recentes mostram que o método bRo5 possibilita a ampliação do espaço amostral de compostos promissores e, por isso, também deve ser considerado nas predições.

Por fim, o avanço de técnicas computacionais permitiu o desenvolvimento de ferramentas de livre acesso e de análises em larga escala para triagem de substâncias líderes, impactando no desenvolvimento de fármacos tanto economicamente quanto temporalmente. Vale ressaltar que não há um protocolo único a ser seguido e a utilização de diferentes preditores e metodologias enriquece a pesquisa, aumentando a probabilidade de sucesso ao destacar um composto líder.

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