Resumo. Enriquecer proteínas alternativas com aminoácidos essenciais e semiessenciais podem se tornar cruciais para a saúde humana, especialmente em populações vulneráveis (crianças e idosos). A deficiência desses aminoácidos causa graves prejuízos ao desenvolvimento e à saúde, como a desnutrição crônica. Utilizando ferramentas de bioinformática (inicialmente BLOSUM62 e mCSM), iremos enriquecer proteínas com um único tipo ou um conjunto de aminoácidos essenciais mantendo sua estrutura globular. Selecionando proteínas menores e bem resolvidas para simular substituições de aminoácidos, buscando maximizar o enriquecimento sem perder a estabilidade estrutural (dobramento correto). Modelagens e simulações de dinâmica molecular (Gromacs/NAMD3) estão sendo usadas para avaliar a estabilidade destas proteínas. Resultados iniciais com a mioglobina mostram que é possível atingir altas porcentagens de substituição (até 55,3% para leucina) mantendo sua estabilidade até o tempo de simulação testado. O estudo continuará explorando outros indicadores e posições estruturais sensíveis para otimizar o enriquecimento proteico.
Autores: Juliana Rodrigues Pereira Silva, Estela Mariana Guimarães Lourenço, Raquel Cardoso de Melo-Minardi, José Miguel Ortega
1. Introdução
O acesso a quantidades de alimentos adequados e de qualidade é fundamental para manter a integridade metabólica e fisiológica, sendo uma das bases materiais para a própria dignidade da existência humana [1], [2]. Mas a fome e a insegurança alimentar permanecem altas, em grande parte por mudanças climáticas e conflitos sociopolíticos, apesar da capacidade global de produção de alimentos serem suficientes para a necessidade atual [3]. Ainda assim, essa demanda irá aumentar à medida que a população cresce. Neste contexto, proteínas alternativas tem sido uma opção necessária para os desafios de segurança alimentar. Fontes nutricionais de proteínas que não vem da agricultura tradicional, podem ser de origem microbiana, vegetal, de carnes cultivadas ou até mesmo de insetos, representando uma oportunidade de atenuação e resiliência climática [4].
Proteínas microbianas também conhecidas como proteínas de células únicas (“single-cell proteins” ou SCP), são provenientes da fermentação de microrganismos unicelulares, como fungos, leveduras, microalgas e bactérias [4]. Sua produção ocupa espaços reduzidos e bem controlados, como os setores de fermentação industrial, não dependendo das condições climáticas, sazonais ou de fertilidade do solo [4]. Seu potencial em usar subprodutos e resíduos da agroindústria reduz o impacto ambiental e os custos de fabricação, convertendo o problema do descarte em uma solução relevante [4], [5]. Embora os SCPs apresentem muitas vantagens em comparação as fontes de proteína convencionais, existem alguns desafios relacionados a sua produção. A possibilidade de substâncias prejudiciais à saúde humana, como toxinas, ácidos nucleicos (RNA), alérgenos, patógenos, entre outros, torna essencial a adoção de medidas preventivas [4]. Sendo uma estratégia em relação, por exemplo, aos ácidos nucleicos, selecionar um microrganismo mais apropriado ou métodos que os removam ou o degradem [4]. Aspectos sensoriais, como aparência, sabor, textura e aroma podem ser uma barreia, fora o ceticismo do consumidor com um alimento produzido biotecnologicamente, gerando resistência atribuído a preocupações com segurança e matéria-prima utilizada [6].
Em um artigo de 2005 [7], foi proposto expressar a proteína de reserva (vitelogenina) em leveduras recombinantes, a fim de melhorar a oferta proteica para artêmias e, posteriormente, estas artêmias, usadas na alimentação de tilápias. Esse trabalho motivou a idealizar metodologias de bioinformática para enriquecer quaisquer proteínas alternativas com aminoácidos essenciais sem a perda de sua estrutura globular, originando este projeto de doutorado. Aminoácidos essenciais são aminoácidos que animais não são capazes de sintetizar e precisam ser adquiridas pela alimentação [8]. Eles são representados por valina (V), isoleucina (I), leucina (L), fenilalanina (F), metionina (M), triptofano (W), histidina (H), lisina (K) e treonina (T) [8]. Já os semiessenciais ou condicionalmente essenciais, são aminoácidos que são sintetizados, mas que em uma maior demanda como por exemplo, atividade física intensa ou traumas, o corpo não consegue produzir em quantidades suficientes [9]. Sendo estes aminoácidos a tirosina (Y), arginina (R), histidina (H) e cisteína (C) [9].
A relevância destes aminoácidos estaria em ser uma opção mais nutritiva a diversas proteínas alternativas que possam vir a ser usadas na alimentação ou suplementação. Deficiência em aminoácidos essenciais pode causar grandes prejuízos a saúde, comprometendo o progresso físico e intelectual, reduzindo a produtividade econômica [1], [2]. Por exemplo, o atrofiamento de crianças com desnutrição crônica (um quarto das crianças menores de 5 anos em todo o mundo), está associado a um padrão alimentar de proteínas com baixo teor de aminoácido essenciais [10]. É preciso destacar que o consumo de alimentos de origem animal é limitado entre crianças de países em desenvolvimento, sendo menos de 5% em muitos países da África subsaariana [10]. Aminoácidos essenciais também se provaram eficientes na construção muscular deste grupo, tendo benefício anabólico [11]. E para síntese proteica muscular em idosas, uma dose baixa de aminoácidos essenciais enriquecidas com leucina se mostrou tão eficaz quanto uma dose muito maior de whey protein [12].
2. Estratégias utilizadas
A pergunta central deste trabalho é até quanto podemos enriquecer proteínas com um único tipo ou um conjunto de aminoácidos essenciais mantendo sua estrutura globular. E para responder essa pergunta estamos usando a bioinformática, testando proteínas que teriam uma porcentagem de seus resíduos originais substituídos por aminoácidos essenciais ou semiessenciais através de trocas planejadas, mantendo sua característica globular, o que é importante, já que proteínas sem dobramentos ou mal dobradas podem levar a agregações, formação de corpos de inclusões, apoptose ou danos a organelas celulares [13], [14]. Brevemente, as estratégias para enriquecer proteínas com aminoácidos essenciais vão se basear ou no escore da matriz de substituição BLOSUM ou, no caso de mCSM, nas predições de substituições que menos desestabilizem a proteína, e os resultados serão publicados futuramente. A estratégia para definir a proporção de enriquecimento com BLOSUM foi iniciar com escores que representam trocas observadas em proteínas homólogas (trocas conservadas) e com mCSM, com base em diferenças entre ΔGs em posição específica, reduzindo a proporção quando ela não permanecer globular no tempo de simulação testado.
No presente momento, alcançamos valores de porcentagem de substituição de resíduos para mioglobina que geraram simulações com estabilização, com RMSD inferior a quatro angstrons, com substituições entre 22 a 43% baseada em BLOSUM62, com resultados iniciais com Gromacs corroborando com NAMD3. Em paralelo, para substituições com base nas predições de estabilidade com mCSM conseguimos percentagens de enriquecimento entre 25 a 55%. Outras métricas como exposição a solvente, globularidade, contatos, estão sendo mensuradas como expressão da instabilidade ao longo da simulação e serão alvo de publicação futura. Preliminarmente, estamos tendo sucesso ao reduzir o tempo de simulação de 200-1000 nanossegundos para apenas 5 nanossegundos realizando a simulação em alta pressão atmosférica, o que nos permitirá avaliar o potencial de enriquecimento de muitas outras proteínas com reduzido tempo computacional. Como a abordagem utilizada gerou um conjunto de mutantes com instabilidades em grau variável, trabalhos futuros podem revelar condições de avaliação rápida de instabilidade.
Agradecimentos: Agências de fomento CAPES, FAPEMIG e as prestadoras de serviços LCC CENAPAD-MG e CELAM.
3. Referências
1. Joint WHO/FAO/UNU Expert Consultation. Protein and amino acid requirements in human nutrition. World Health Organ Tech Rep Ser. 2007;(935):1-265, back cover. PMID: 18330140.
2. Ayala A, Meier BM. A human rights approach to the health implications of food and nutrition insecurity. Public Health Rev. 2017 Mar 9;38:10. doi: 10.1186/s40985-017-0056-5. PMID: 29450082; PMCID: PMC5810069.
3. Marc J. Cohen and Ellen Messer. Food Wars – Conflict, Hunger, and Globalization, 2023. Oxfam. 2024.
4. Bajić et al. Biotechnological Production of Sustainable Microbial Proteins from Agro-Industrial Residues and By-Products. Foods. 2022 Dec 25;12(1):107. doi: 10.3390/foods12010107. PMID: 36613323; PMCID: PMC9818480.
5. Kobayashi et al. Life-cycle assessment of yeast-based single-cell protein production with oat processing side-stream. Sci Total Environ. 2023 May 15;873:162318. doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162318. Epub 2023 Feb 18. PMID: 36805067.
6. Onyeaka et al. 2022, ‘Single Cell Protein for Foods and Feeds: A Review of Trends’, The Open Microbiology Journal, vol. 16, no. 1, e187428582206160. https://doi.org/10.2174/18742858-v16-e2206160
7. Lim EH, Lam TJ, Ding JL. Single-cell protein diet of a novel recombinant vitellogenin yeast enhances growth and survival of first-feeding tilapia (Oreochromis mossambicus) larvae. J Nutr. 2005 Mar;135(3):513-8. doi: 10.1093/jn/135.3.513. PMID: 15735086.
8. ROSE WC. The role of the amino acids in human nutrition. Proc Am Philos Soc. 1947 Feb;91(1):112-6. PMID: 20293557.
9. Hendrickson et al. Conditionally Essential Amino Acid Supplementation Reduces Postoperative Complications and Muscle Wasting After Fracture Fixation: A Randomized Controlled Trial. J Bone Joint Surg Am. 2022 May 4;104(9):759-766. doi: 10.2106/JBJS.21.01014. Epub 2022 Mar 14. PMID: 35286282.
10. Semba et al. Perspective: The Potential Role of Essential Amino Acids and the Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Pathway in the Pathogenesis of Child Stunting. Adv Nutr. 2016 Sep 15;7(5):853-65. doi: 10.3945/an.116.013276. PMID: 27633102; PMCID: PMC5015042.
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13. Martinotti, S.; Ranzato, E. Targeting the Unfolded Protein Response with Natural Products: Therapeutic Potential in ER Stress-Related Diseases. Int. J. Mol. Sci. 2025, 26, 8814. https://doi.org/10.3390/ijms26188814.
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