A intensa demanda global por energia fomenta a busca por fontes renováveis para mitigar a dependência em combustíveis fósseis e reduzir as emissões de gases do efeito estufa. O bioetanol, vital para o setor de transportes no Brasil, quando oriundo de sacarose ou amido de biomassa de primeira geração ( ex,: cana-de-açúcar, milho, beterraba), geralmente compete com o uso alimentar em solos agricultáveis. Uma exceção promissora seria a inulina, um carboidrato de reserva rico em frutose e abundante em plantas do gênero Agave. O cultivo de Agave já é bem estabelecido no Brasil e não compete com terras agrícolas, valorizando ecologica e economicamente áreas semiáridas, mesmo as atualmente degradadas. Entretanto, a eficiência da conversão da inulina em monossacarídeos fermentescíveis, majoritariamente frutose, é limitada, visto que a atividade catalítica e a termoestabilidade das inulinases (família GH32 de glicosídeo hidrolases) estão aquém do necessário para processos industriais. Portanto, é proposta a otimização de inulinases fúngicas reunidas no banco de dados FUNIN, dada a preferência industrial por seu maior rendimento quando comparada às enzimas bacterianas. Computacionalmente, modelos de linguagem de larga-escala de proteínas (ESM-3) serão usados para gerar hipóteses que serão inicialmente testadas por modelagem estrutural (DeepGlycanSite, HADDOCK, GROMACS). Em seguida, as enzimas candidatas passarão por validação biofísica experimental, incluindo dicroísmo circular, SEC-MALS e ressonância magnética nuclear. Objetiva-se aumentar a eficiência da hidrólise e prevenir a reação de transfructosilação, maximizando a produção de frutose para a geração de bioetanol a partir de Agave e impulsionando a sustentabilidade energética.
Autores: Eduardo Horta Santos, Bruno Andrade, Maria Gabriela Bello Koblitz, Aristóteles Góes-Neto
1. Introdução
Dentre os agravantes das mudanças climáticas, destaca-se a dependência energética em combustíveis fósseis, os quais atenderam 80% da demanda energética global em 2023 [1]. O bioetanol é uma forte alternativa no Brasil, com 21% de participação nas demandas do transporte rodoviário em 2024 [1]. Contudo, a biomassa de primeira geração na produção de bioetanol geralmente enfrenta resistência devido ao desvio de uso de terras agrícolas (e.g. cana-de-açúcar, milho, beterraba) [2]. Uma solução é ofertada pela inulina, carboidrato de reserva rico em frutose, presente nas raízes e tubérculos de diversas plantas, muitas de regiões semiáridas, como o Agave. O cultivo de Agave pode se aproveitar de terras inadequadas ao plantio de alimentos, contornando a maior limitação das biomassas de primeira geração. Apesar disso, a biomassa de Agave ainda é muito pouco explorada. Por exemplo, apenas 4% das folhas de Agave sisalana (sisal) originam a fibra comercializada, verificando-se a produção de 24 toneladas de resíduos orgânicos por tonelada de fibra [3]. Ademais, o sisal já se encontra bem estabelecido no Brasil, concentrado em regiões onde poucas culturas comerciais são viáveis, particularmente no estado da Bahia, o qual contribui com 90% à produção nacional [3].
Nesse cenário, destacam-se as inulinases, enzimas da família das glicosídeo hidrolases 32 (GH32), que são responsáveis pela hidrólise da inulina. No entanto, a degradação enzimática da inulina requer avanços consideráveis para rendimento industrial com as inulinases, visando elevar suas propriedades críticas de eficiência catalítica e termoestabilidade. Trata-se, porém, de problemas multifatoriais que até o momento têm sido abordados de forma pontual, com estudos de caracterização e otimização de poucas enzimas por vez. A abordagem do presente trabalho (Figura 1) envolve o uso do banco de dados FUNIN de inulinases fúngicas, o que permitirá uma visão ampla do grupo essencial para entender as possibilidades de otimização dessas enzimas por inteligência artificial (IA), modelagem estrutural e validação biofísica.
Dessa forma, o modelo de linguagem de larga-escala de proteínas ESM-3 será usado como base para a geração de hipóteses a partir das inulinases no FUNIN, evidenciando padrões ocultos que podem informar a escolha de mutações interessantes, sejam elas novas ou complementares às descritas na literatura, assim como apontar quais as melhores enzimas para otimização. O ESM-3 acessa informação para além de padrões diretos nas sequências de entrada, sendo capaz de explicitar relações não-aparentes entre sequência, estrutura e função aprendidas a partir do treinamento com bilhões de proteínas advindas de diversos bancos de dados de sequência e estrutura [4]. O método organiza o conhecimento em um espaço interno onde tendências evolutivas, aspectos funcionais e motivos estruturais se reúnem, tornando esses dados mais acessíveis. Isso permite ultrapassar similaridades e padrões óbvios, podendo recuperar, através de seus impactos estruturais e funcionais, restrições bioquímicas que a literatura ainda não descreveu adequadamente nas GH32. Logo, o ESM-3 fornece um ponto de partida objetivo e inovador para definir mutações relevantes e selecionar enzimas com melhor potencial de otimização. Além disso, o modelo produz resultados que facilitam o uso posterior de ferramentas estruturais, ao filtrar os conjuntos de enzimas e mutações quanto à sua coerência geométrica e funcional, acelerando o processo em direção à modelagem estrutural dos candidatos. Primeiramente, ferramentas especializadas na predição de sítios de ligação a glicanos, como o DeepGlycanSite [5], fornecerão informação adicional para o acoplamento (HADDOCK [6]) e simulação de dinâmica molecular (GROMACS [7]) de complexos enzima-substrato. Com base nesses resultados, o conjunto filtrado de inulinases e variantes passará por validação com técnicas de biofísica experimental, almejando confirmar e entender de forma mecanística os comportamentos dos complexos modelados. Será realizada uma validação hierárquica, conforme o estudo de Jendrusch et al. de 2025 [8], implicando no uso de técnicas como dicroísmo circular (CD), Size Exclusion Chromatography – Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS), ressonância magnética nuclear (RMN) e ensaios funcionais.
2. Resultados Esperados
São previstos avanços na sustentabilidade da produção de Agave, associando o tratamento dos resíduos com a geração de bioetanol. Paralelamente, o uso de IA na engenharia de proteínas vem demonstrando resultados promissores em trabalhos recentes: a geração de uma nova proteína fluorescente razoavelmente distante de qualquer outra conhecida (identidade máxima de 58%) [4], além do design de novo de inibidores da defesa bacteriana a fagos [8]. É razoável que abordagens nessa interface sustentem a geração de novas alternativas enzimáticas à hidrólise de carboidratos, sendo este trabalho um pioneiro na área. Finalmente, a modelagem de complexos proteína-carboidrato implica em desafios inerentes à grande flexibilidade do carboidrato e quantidade comparativamente baixa de dados experimentais disponíveis para esses complexos [9]. Assim, inovações metodológicas podem ser necessárias para permitir uma visão mais integrada dos mecanismos e relações inerentes aos padrões encontrados, uma demanda que será atendida ao longo do projeto. Crucialmente, o ESM-3 figura como mecanismo de aprofundamento na extração de padrões não-evidentes da diversidade das GH32, muito frequentemente inalcançáveis por métodos tradicionais como alinhamento, predição estrutural ou identificação de motivos descritos.
3. Conclusão
Conforme exposto, a proposta deste trabalho engendra ganhos não só para a valorização da biomassa de Agave, mas também inovação metodológica no estudo das inulinases e GHs como um todo. Por meio da integração entre modelos de IA e modelagem estrutural, é possível orientar etapas experimentais, primariamente biofísicas, que validem as hipóteses fundamentadas nas relações ressaltadas computacionalmente. Por fim, a estratégia estabelece um caminho claro para a otimização das inulinases, promovendo sua aplicabilidade industrial mediante aprofundamento científico, assim como o enriquecimento regional e a economia circular.
Agradecimentos. Os autores agradecem ao programa de pós-graduação em Bioinformática da UFMG.
4. Referências
1. IEA. World Energy Outlook 2024 [Internet]. Paris: IEA; 2024 [cited 2025 Jul 16]. Available from: https://www.iea.org/reports/world-energy-outlook-2024
2. Igwebuike CM, Awad S, Andrès Y. Renewable Energy Potential: Second-Generation Biomass as Feedstock for Bioethanol Production. Molecules. 2024 Jan;29(7):1619.
3. Broeren MLM, Dellaert SNC, Cok B, Patel MK, Worrell E, Shen L. Life cycle assessment of sisal fibre – Exploring how local practices can influence environmental performance. J Clean Prod. 2017 Apr 15;149:818–27.
4. Hayes T, Rao R, Akin H, Sofroniew NJ, Oktay D, Lin Z, et al. Simulating 500 million years of evolution with a language model [Internet]. bioRxiv; 2024 [cited 2025 Jul 18]. p. 2024.07.01.600583. Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.07.01.600583v2
5. He X, Zhao L, Tian Y, Li R, Chu Q, Gu Z, et al. Highly accurate carbohydrate-binding site prediction with DeepGlycanSite. Nat Commun. 2024 Jun 17;15(1):5163.
6. Ranaudo A, Giulini M, Pelissou Ayuso A, Bonvin AMJJ. Modeling Protein–Glycan Interactions with HADDOCK. J Chem Inf Model. 2024 Oct 14;64(19):7816–25.
7. Trapala J, González-Andrade M, Olvera C, Cayetano-Cruz M, Sanz-Aparicio J, Jimenez-Ortega E, et al. Relevance of aromatic and polar amino acids in the specificity of Inulinase ISO3 from Kluyveromyces marxianus: A molecular dynamics approach with an experimental verification. Int J Biol Macromol. 2023 Jul 1;242:124734.
8. Jendrusch MA, Yang ALJ, Cacace E, Bobonis J, Voogdt CGP, Kaspar S, et al. AlphaDesign: a de novo protein design framework based on AlphaFold. Mol Syst Biol. 2025 Jun 17;21(9):1166–89.
9. Nieto-Fabregat F, Lenza MP, Marseglia A, Carluccio CD, Molinaro A, Silipo A, et al. Computational toolbox for the analysis of protein–glycan interactions. Beilstein J Org Chem. 2024 Aug 22;20(1):2084–107.