A resposta imune humoral depende de um repertório diversificado de anticorpos gerados pela recombinação somática de segmentos do gene da imunoglobulina (Ig) nos linfócitos B. Os anticorpos consistem tipicamente em duas cadeias leves (L) e duas cadeias pesadas (H) ligadas por pontes dissulfeto, cada uma contendo regiões constantes (C) e variáveis (V). As regiões variáveis geralmente são responsáveis por interações específicas com antígenos. Além da recombinação V(D)J, existem diferentes mecanismos que geram a diversidade dos anticorpos, como a hipermutação somática, a conversão gênica e a recombinação de troca de classe, que aumentam ainda mais a diversidade de anticorpos com a enzima citidina desaminase induzida por ativação (AID) desempenhando um papel central. Dentre esses processos, a conversão gênica é um dos menos estudados. Esse mecanismo depende da introdução de segmentos de pseudogenes em genes funcionais. Com o intuito de identificar eventos de conversão gênica no repertório de imunoglobulinas da região variável da cadeia pesada (IGHV) de cavalos, dados de sequenciamento de Ig podem ser utilizados na identificação desses eventos em larga escala. Esse tipo de estudo pode trazer uma nova perspectiva na atuação de pseudogenes como geradores de diversidade em anticorpos, além de promover um melhor entendimento da resposta imunológica equina.
Autores: Juliana Edelvacy Lima Pinto, João Henrique Diniz Brandão Gervásio, Joseph Chi-fung Ng, Carlena Navas, Liza Figueiredo Felicori
1. Introdução
No final do século XIX (1890), Behring e Kitasato foram pioneiros ao usar soro de animais como coelhos e cavalos imunizados para desenvolver antitoxinas contra a difteria e o tétano, respectivamente. Em 1891, Behring alcançou o primeiro tratamento bem-sucedido de uma criança contra difteria, uma descoberta que lhe rendeu o primeiro Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1901 [1,2]. Desde então, os cavalos continuam indispensáveis para a produção de antivenenos no Brasil e foram também empregados durante a pandemia da COVID-19 para a produção de soros terapêuticos em países como a Argentina [3]. Seu uso extensivo é justificado principalmente pelo alto volume sanguíneo desses animais e pela grande capacidade neutralizante de seus anticorpos, que permite a coleta repetida de sangue para o isolamento de grandes quantidades de anticorpos potentes com o intuito de utilizá-los em aplicações terapêuticas [4]. No entanto, apesar de sua relevância biotecnológica de longa data, estudos com foco no repertório de imunoglobulinas equinas permanecem limitados.
Em relação à organização do locus desta espécie, sabe-se atualmente que o locus da cadeia pesada da imunoglobulina equina (IGH) está localizado no cromossomo 24 e compreende 104 genes da região variável IGHV (agrupados em 7 subgrupos), 44 genes IGHD, 9 genes IGHJ e 11 genes IGHC (constantes). Dos 104 genes variáveis, apenas cerca de 21 genes IGHV são funcionais, seguidos por 9 genes com potencial de serem traduzidos -frames de leitura abertos (ORFs)- mas com alterações nos sítios de splicing, nos sinais de recombinação e/ou em elementos regulatórios, e/ou mudanças em aminoácidos conservados que levam ao dobramento incorreto, e/ou a entidade é um orfão e 74 pseudogenes [5, 6]. Curiosamente, os pseudogenes superam em número os genes funcionais na IGHV equina. Além disso, trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que, dos 21 genes funcionais, apenas 3 são usados em mais de 80% do repertório de IGHV em cavalos, sugerindo que o rearranjo gênico pode não ser o principal mecanismo gerador da diversidade de anticorpos nesta espécie [7]. Portanto, como existem estudos que sugerem que os pseudogenes podem contribuir para a diversidade de imunoglobulinas em outras espécies [8], começamos a nos perguntar se esses pseudogenes poderiam desempenhar um papel significativo na diversidade de anticorpos em cavalos.
Os pseudogenes (PGs) são sequências genômicas bastante semelhantes a genes funcionais, mas com funcionalidade alterada ou perdida, presentes em todas as formas de vida [9]. Embora sua relevância biológica tenha sido debatida por muito tempo, evidências crescentes apoiam seus papéis funcionais [10–12]. Um deles, particularmente relevante para imunoglobulinas, é a transferência de segmentos de PGs para genes funcionais por meio de recombinação não alélica, conhecida como conversão gênica [13]. Esse mecanismo tem se mostrado a principal forma pela qual a diversidade de anticorpos é gerada em galinhas e coelhos, integrando fragmentos de PGs em segmentos V recombinados de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas [14–16]. No entanto, embora a conversão gênica tenha sido bem documentada em galinhas e coelhos, sua ocorrência em imunoglobulinas equinas não é bem compreendida, mesmo que esses animais tenham a maquinaria necessária para esse processo [17].
Além disso, nos últimos anos, abordagens bioinformáticas foram desenvolvidas para identificar eventos de conversão gênica, todavia, apesar da variedade de métodos disponíveis, a maioria não é especificamente voltada para o estudo de imunoglobulinas e apresenta desempenho limitado ao lidar com grandes volumes de dados [18-20]. Isso destaca a necessidade de desenvolver novos métodos ou aprimorar os existentes para identificar eventos de conversão gênica que sejam adaptados ao grande volume de dados gerados pelas mais recentes tecnologias de sequenciamento de imunoglobulinas e capazes de serem validados. Assim, este estudo tem como objetivo apresentar formas para realizar a identificação de eventos de conversão gênica nos segmentos gênicos de IGHV de cavalos. A elucidação da conversão gênica em imunoglobulinas equinas pode revelar novos mecanismos de diversidade de anticorpos, com aplicações potenciais no desenvolvimento de vacinas e na produção de anticorpos terapêuticos, semelhantes aos avanços já alcançados com imunoglobulinas de galinha [21].
2. Abordagem Integrada para Estudo da Diversidade de Imunoglobulinas Equinas
A compreensão dos mecanismos que geram diversidade no repertório de imunoglobulinas em equinos requer uma abordagem metodológica integrada, que combina técnicas avançadas de biologia molecular com ferramentas bioinformáticas. O sequenciamento de nova geração (NGS) emerge como ferramenta fundamental neste contexto, permitindo a caracterização em larga escala das sequências da região variável da cadeia pesada de anticorpos (IGHV). A relevância desta pesquisa reside na interação entre a geração massiva de dados transcriptômicos (sequenciamento de transcritos de células B, ou BCR-seq) e o desenvolvimento de pipelines bioinformáticos especializados para detectar eventos moleculares específicos, particularmente a conversão gênica.
A identificação dos eventos inicia-se com a coleta de amostras sanguíneas de cavalos (Figura 1), por meio do isolamento de células mononucleares seguido pelo isolamento do transcriptoma (Sequências de RNA) de linfócitos B, que é convertido em DNA complementar (cDNA). A amplificação seletiva via PCR multiplex, utilizando primers específicos para os segmentos IGHV, assegura a especificidade do conjunto de dados, direcionando o sequenciamento especificamente para o gene de interesse. Assim, as sequências de cDNA são preparadas para o sequenciamento Illumina MiSeq, por meio da ligação de adaptadores específicos. Essa técnica de sequenciamento gera um volume substancial de leituras (reads) pareadas (paired-end), constituindo uma representação abrangente do repertório de anticorpos em cada cavalo. A transformação desses dados brutos em informações biologicamente significativas exige um pipeline computacional robusto. O framework Immcantation [22] pode ser empregado para etapas críticas de pré-processamento, controle de qualidade e montagem das sequências, garantindo a integridade dos dados subsequentes. A anotação das sequências pode ser realizada através de comparação com bancos de dados curados como o IMGT/HighV-QUEST [23], permitindo a atribuição de cada sequência de anticorpo a sua provável origem germinativa.
Figura 1. Identificação de Eventos de Conversão Gênica em Anticorpos de Cavalos. (1) A identificação de eventos de conversão se inicia com a coleta de amostras sanguíneas e separação de células mononucleares. (2) Essas amostras têm o seu RNA isolado. (3) O RNA é convertido em DNA complementar (cDNA) e amplificado utilizando primers específicos. (4) O DNA amplificado será preparado para o sequenciamento por meio da ligação de adaptadores e amplificação. (4) As sequências serão sequenciadas em sequenciadores de nova geração, como Illumina. (5) As sequências serão pré-processadas e anotadas utilizando bancos de dados públicos como o IMGT. (6) Com as sequências anotadas, estas terão os eventos de conversão gênica identificados por meio do uso de softwares específicos. (7) Os dados são analisados usando programas na linguagem R e Python e os gráficos podem ser representados no programa Prism.
A identificação de eventos de conversão gênica pode ser realizada mediante comparação sistemática de cada sequência recombinada com o conjunto completo de genes e pseudogenes da IGHV do genoma equino, utilizando algoritmos como o BrepConvert [24]. A detecção de segmentos nucleotídicos com maior identidade a pseudogenes do que aos seus genes funcionais correspondentes constitui evidência primária para inferência de eventos de conversão gênica. As etapas subsequentes de caracterização, incluindo quantificação da frequência relativa dos eventos e identificação de pseudogenes doadores preferenciais, podem ser realizadas utilizando scripts na linguagem R e Python e visualizadas utilizando ferramentas como o GraphPad Prism.
3. Conclusão
Em síntese, esta abordagem metodológica integrada demonstra como a combinação entre técnicas avançadas de sequenciamento e análise bioinformática permite converter dados transcriptômicos brutos em evidências validadas sobre mecanismos moleculares específicos. Cada evento de conversão gênica identificado representa uma possível fonte de diversidade em anticorpos equinos. Essa inferência é suportada pela utilização de dados de sequenciamento de alta resolução e pipelines adequados para a pergunta do estudo, contribuindo para o entendimento de mecanismos fundamentais na imunobiologia equina e que podem ser transpostos para identificação destes eventos em outras espécies.
Agradecimentos. Os autores agradecem às agências de fomento à pesquisa: CAPES, CNPq e Fapemig.
4. Referências
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